FAQ
 

Q1:建库所需的样品总量和浓度有什么要求?
A1:不同文库所用的试剂盒对样品总量和浓度有不同的要求,具体要求见《高通量测序样品要求及注意事项》,为了保证文库质量,在条件允许的情况下请尽可能多提供一些样品。

Q2:对建库所用样品的保存和运输有什么要求?
A2:一般情况下,DNA样品应保存于-20℃,RNA样品应保存于-80℃,若长期保存最好都置于-80℃;DNA样品运输可选用冰、干冰或液氮,RNA样品应保存于干冰或液氮中运输。

Q3:构建的RNA文库是不是也包含了small RNA?
A3:不是的,在RNA文库构建中会先进行mRNA的纯化,只有带有poly A尾的mRNA会被保留下来,small RNA没有poly A尾,所以在纯化的过程中已丢失。若要做small RNA分析,需要专门构建small RNA文库。

Q4:你们是否提供链特异性RNA文库构建服务?
A4:提供,若要构建链特异性RNA文库请在样品信息单中选择建库类型“Directional RNA-Seq”。

Q5:我们提交样品后多久能够得到测序结果?
A5:样品提交后要经过样品质检→文库构建→文库质检→上机测序→数据初步分析等几个阶段,一般情况下,一个月左右就能获得结果。

Q6:如何选择所构建DNA文库片段的大小?
A6:单端测序(single end)最优的片段大小是150-300bp,双端测序(paired end)最优的片段大小为250-500bp。目前,我们提供180bp、300bp和500bp三种大小的DNA文库构建服务,180bp大小文库采用双端测序能够测通,而300bp和500bp大小的文库则无法测通。文库大小的选择还与基因组的复杂度和重复序列多少有关,大文库有利于高重复序列基因组DNA序列的拼接。

Q7:你们是否提供rRNA Removal的RNA建库服务?
A7:提供,若要构建rRNA Removal的RNA文库请在样品信息单中选择建库类型“rRNA Removal RNA-Seq”。,并自行提供去除rRNA的试剂盒。

Q8:如何确定测序所需的数据量?
A8:测序所需的数据量与研究类型、基因表达丰度、基因组大小有关,同时还与已发表文献中已使用的数据覆盖度有关。一般而言,对全基因组重测序SNP分析,可以采用30-50X的覆盖深度。对RNA测序,一般要求4G的数据量,若要获得低丰度的转录本,还要进一步增加数据量。

Q9:small RNA建库提交样品前是否要先分离纯化small RNA?
A9:不需要,small RNA文库构建直接以total RNA起始。利用small RNA在5’端带有磷酸基,3’端带有羟基的特性,直接在两端连上接头,再通过反转录、PCR扩增和PAGE胶电泳回收最终获得small RNA文库。

Q10:以total RNA起始所构建的small RNA文库中会有mRNA或rRNA污染吗?
A10:一般不会,因为在small RNA建库过程中需要进行PAGE胶电泳纯化,只有符合small RNA大小的片段才回收。因此,只有降解或断裂到与small RNA片段大小相同且两端连接上正确接头的mRNA或rRNA才有可能被引入small RNA文库,而样品建库前都要经过严格的质检,降解的样品是不建议建库的,所以mRNA或rRNA污染的概率是很小的。

Q11:单端测序与双端测序有什么不同,该如何选择?
A11:单端测序指在测序过程中只从构建的文库一段读取100bp长度,而双端测序则分别从文库两端各读取100bp长度。一般而言,small RNA文库和ChIP文库按不同需求可以选择单端测序(也可用双端测序),而其它文库基本采用双端测序。

Q12:与microarray技术相比较,NGS技术有什么优点?
A12:相对与microarray技术,NGS技术有如下一些优势:

a. NGS技术可以在基因组序列未知的情况下进行测序,而microarray技术则要求已知的基因组信息来设计芯片上的探针序列
b. NGS技术的结果中可包含一些未知的序列信息,而microarray技术只能检测到芯片上已有的序列信息,而无法检测未知序列
c. 基于杂交原理的microarray技术在检测相似序列时分辨率较低,通常会存在cross-hybridization的问题;而NGS技术的分辨率可以达到一个碱基,能够轻易区分单个碱基的不同
d. NGS技术样品要求量低,microarray技术样品要求量高;NGS技术信噪比较高,,microarray技术信噪比较低。