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孙育杰组开发基于改造sgRNA的活细胞染色质位点的多色标记成像技术

时间:2016/2/26   放大字体 放小字体 打印

北京大学生命科学学院生物动态光学成像中心孙育杰课题组近日在Nucleic Acids Research在线发表题为“Long-term Dual-color Tracking of Genomic Loci by Modified sgRNAs of the CRISPR/Cas9 System”的文章。利用可编辑的内切酶失活的人工核酸酶(CRISPR/dCas9)作为DNA结合蛋白,开发了一种新的基于改造的功能性扩展sgRNACRISPR多色、稳定的荧光成像系统。

基因在细胞核中的位置和细胞生命活动中基因位点的动态变化是真核细胞基因表达调控的一个重要层面。因此对活细胞内染色体基因位点运动过程实现高效,可信,稳定的多色多基因位点同时标记观测与追踪对于理解拥挤细胞核内很多动态过程非常关键。近几十年已经发展了多种DNA标记技术,其中最近出现的利用可编辑的DNA结合蛋白进行标记的方法因操作方便、可扩展性好等优点脱颖而出。



改造sgRNA的原理示意图和标记效果图




CRISPR系统的特异性是由sgRNA决定而非Cas9蛋白,传统的利用dCas9直接标记成像只能实现单色标记。该工作开发了基于改造sgRNA的基因位点多色标记新方法。当改造的sgRNAdCas9形成复合物时,可以结合到靶位点并且通过适配子结合蛋白招募荧光蛋白到靶位点进行放大。文章通过对染色体端粒和着丝粒同时成像证明了标记系统在双色成像上的表现。通过与传统标记方法的共定位说明了新开发系统的特异性。与传统的荧光原位杂交(FISH)和多重重复片段插入(FROS)等技术相比,这种新的成像方法适合标记活细胞,操作简单、易实现。与dCas9标记方法相比,基于改造sgRNA的方法提供了更加快速交换的动力学,可以抵抗光漂白的影响,特别适合对于基因位点的长时间连续观察追踪。基于改造sgRNA的多色成像方法具有较高的特异性、信噪比、灵敏度、通用性,可以和基于正交Cas9的多色成像方法进行互补,进一步提高多色标记的通量。该技术未来可以应用于多基因的共转录,DNA修复,染色质的结构变化等方面的研究,对于理解基因位置与基因表达调控具有重要的意义。

该工作于201524日在线发表于Nucleic Acids Research。北京大学三年级博士生邵世鹏是该论文的第一作者,北京大学生物动态光学成像中心孙育杰研究员是该论文的通讯作者。该研究得到了国家自然科学基金、科技部“863计划,青年千人计划项目的资助。

 

 

Long-term dual-color tracking of genomic loci by modified sgRNAs of the CRISPR/Cas9 system, Shipeng Shao1, Weiwei Zhang1, Huan Hu2, Boxin Xue1, Jinshan Qin1, Chaoying Sun1, Yuao Sun1, Wensheng Wei3 and Yujie Sun1,*Nucl. Acids Res. (2016) doi: 10.1093/nar/gkw066, First published online: February 4, 2016