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【直播实录】北京大学谢晓亮教授:单细胞基因组学迎战新冠肺炎

时间:2020/04/08   放大字体 放小字体 打印

 

 

谢晓亮:谢谢未来论坛的邀请,大家好!首先,我想借此机会,衷心感谢英雄的武汉人民,向一线的医护工作者们致以崇高的敬意。我有两个朋友也加入了援鄂医疗队,我非常敬佩他们。

 

今晚的科普讲座,我想跟大家分享的是,作为后方的科学工作者,我们如何通过单细胞基因组学迎战新冠肺炎。

 

新冠肺炎席卷全球,控制疫情涉及四个方面:检测、隔离、预防和治疗。根据过去几个月国内外疫情的发展,大家应该已经充分意识到了检测和隔离的重要性,我今天的演讲主要涉及预防和治疗。

 

谈到预防,人们纷纷把希望寄托在疫苗上。眼下全世界很多科学家正在研制疫苗,估计要年底才能出来。在疫苗出来之前,除了隔离,我们还能做什么呢?世界急需的是强有效的治疗方法,来降低死亡率,但是目前还没有特效药。

 

从上周中欧抗疫交流会上和前几天的临床结果,我们了解到,小分子药物氯奎和羟氯奎在轻症患者上有一定效果,现在美国也开始使用了。小分子药物,也就是化学合成药物,一般研制周期很长,比如说十年。所以目前都是旧药新用,药效有限。

 

除小分子药物外,血浆疗法也初见成效。血浆疗法就是把康复期病人的血浆离心,取上层清澈的血浆部分注射给病人。这是一种传统疗法,现在在美国等国家也开始使用。

 

血浆疗法虽好,但有一定风险,因为血浆因人而异,是一个复杂的混合物;而且血浆来源有限,不可能大规模使用

 

康复期病人的血浆中的关键成分是免疫系统产生的某种抗体。抗体是一种蛋白质,它的分子量是氢原子的15万倍。所有抗体都有Y字形状的结构,像两把“钳子”,用来捕捉抗原。那对我们来说,抗原就是新冠病毒

 

 

新冠病毒是一种RNA 病毒,它的外壳上有刺突状的S蛋白。S蛋白上面的红色的部分是冠状病毒的受体结合域(Receptor Binding Domain, RBD)。

 

新冠病毒入侵细胞时,S蛋白与人体细胞的表面受体ACE2结合,随后病毒被内化,进入细胞,在细胞内被转录酶复制,重新组装成大量新的病毒,又去继续感染其他细胞。

 

 

抗体有很多种,我们关心的是中和抗体。中和的意思就像酸来了,我们用碱来中和;病毒来了,细胞用抗体来中和。中和抗体的作用是牢牢地结合到病毒上,改变它的功能,阻止它侵入细胞。我们的目标是快速找到并制备高纯度中和抗体,作为药物,代替血浆给病人注射

 

抗体药物是一种大分子药物,与小分子药物相比,它的特异性好,副作用小,近年来有不少成功的例子

 

艾滋病原来是不治之症,2018年以后美国FDA批准HIV的抗体药物,与其他抗病毒逆转录的药物联合使用。

 

埃博拉病毒,三种单克隆抗体已获美国FDA批准,目前正在临床开发中。2015年,由军事医学科学院研发的抗体药物MIL77成功治愈1名确诊埃博拉病毒的感染者。

 

中东呼吸综合征(MERS),2018年经过基因改造的牛生产的针对MERS病毒的人类抗体,在一期临床试验中表现良好。二期临床因为疫情消失无法继续。

 

以上这三种抗体药物都是中和抗体。但问题是找到这些抗体的时间太长。采用的是单细胞克隆放大的方法,需要几个月。我们现在就是要缩短这个时间。

 

我这里顺便提一下癌症。截止2018年,全球将近500个抗体新药进入临床试验。它们不是中和抗体,而是与T细胞有关的抗体。其中以PD-1/PD-L1为靶点的抗体是研究热点。

 

 

回到我们的课题:如何快速找到并制备高纯度的中和抗体?

 

血浆中的抗体不计其数,种类约有10的7-8次方之多。想在血浆中直接找到新冠病毒的中和抗体,犹如大海捞针,目前无法实现。反正我不知道怎么做。

 

我们需要走另外一个途径,那就是先找到产生抗体的细胞。离心后血浆下面的这层是白细胞,其中包括人体内两大免疫细胞,T细胞和B细胞。我们今天只讲B细胞。

 

B细胞是生产抗体的,它产生于骨髓,通过血液和淋巴液分布到全身的淋巴结。但是B细胞种类繁多,每个B细胞只生产某一种特定的抗体;而这种抗体是由B细胞的DNA序列决定的。所以我们采用的办法就是通过对B细胞进行RNA测序来找到我们想要的中和抗体。

 

 

我们寻找新冠病毒中和抗体之路开始于大年初三,曹云龙在几个月前刚从哈佛拿到博士学位,他是我的哈佛实验室里唯一一个跟我回国的。我们不是专门搞病毒或者免疫学的,单细胞基因组学是我们的专长。一开始我们只是想为抗疫做点事情,当意识到单细胞基因组学也许有可能帮助找到中和抗体的时候,我们非常兴奋,立马开始读文献,制定实验方案,四处寻找仪器和试剂。北大和北京市各单位的同事十分给力,所以很快就万事俱备。

 

2月2号,我和我们中心的苏晓东教授,测序平台负责人耿晨阳去了佑安医院。在这里见到金院长和冯处长,他们当即就同意合作,要提供康复期病人的血样。紧接着医院的粟斌和郭向华研究员来到我们中心,完成单细胞测序技术的培训后就回到医院的P2+实验室,类似于P3实验室,所以他们要穿防护服等装备。按理每天只应该工作5个小时,但他们经常超时工作,还被隔离了整整两个月。

 

在进一步解释之前,我需要先给大家一些背景知识

 

谈到测序,大家知道这次疫情爆发后,中国科学家在一个月内就测出新冠病毒的完整序列,并在第一时间向全球公布,为新冠肺炎的检测和研究奠定了基础。相比之下03年SARS爆发时,最早的序列用了5个月的时间才测出来,是由加拿大的团队最先公布的。

 

就在SARS发生的同一年,人类基因组计划完成了,这是人类历史上的一个里程碑。当时一家美国的私人公司和美国组织的国际团队激烈竞争。私人队的队长Craig Venter测的是他自己的基因组。而美国领导的国际团队耗资30亿美金,测的是6、7个人的组合。

 

在人体细胞的细胞核里有 46 条染色体,23 条来自于父亲,23条来自于母亲,染色体的主要成分是遗传物质DNA。大家知道,二十世纪最伟大的生物学发现是 Waston 和 Crick的DNA双螺旋结构。DNA有四种碱基 A、T、C、G,  A与 T 配对,C与G配对。简单地说,碱基排列的序列,像这里,GTGACAG, 决定了遗传信息,也就是基因。人类基因组有60亿对碱基,共有两万多个基因,对应两万多个蛋白质。人与人相比,绝大部分的碱基都是相同的,只有千分之一碱基序列的差别决定了我们之间的不同。比如说这里,这一个人体细胞里,来自父亲和母亲的DNA,他们的差别只是千分之一的碱基。

 

按照分子生物学的中心法则,DNA携带的遗传信息,即基因序列,用来在转录过程中由转录酶产生信使RNA,接着在翻译过程中由核糖体生成蛋白质。蛋白质是以氨基酸为基本单位的生物大分子,一共有二十种氨基酸,它们手拉手得接起来形成链状大分子,然后再折叠起来成为蛋白质,比如说Y字型的抗体蛋白。

 

蛋白质的合成遵循遗传密码。三个的DNA碱基决定一个氨基酸。这里是二十个氨基酸对应的碱基序列。所以DNA的序列和蛋白质的序列有一一对应的关系。

 

其实转录和翻译并不一定要在人体内进行,有了基因序列,我们可以利用转录酶和核糖体在体外生产抗体蛋白

 

十七年过去了,生物基因检测技术有了突飞猛进的发展。今天我就是想讲怎么利用最新技术解决当下的问题

 

2007年发生了新一代DNA测序仪的革命,使得测序价格的下降速度比半导体工业的指数衰减还快。现在只要1000美元,在一天之内就可以完成个人基因组的测序。新一代测序仪使得个体化医疗成为可能。也就是说通过个人基因组的信息来了解病因,为治疗和预防疾病提供个性化方案。

 

人类基因组和新一代测序仪之后的另一个革命是单细胞基因组学。也就是说你给我一个单个的人体细胞,我就可以告诉你它整个的基因组。这是怎么实现的呢?现在还没有一种技术可以把一个细胞里的46根染色体每根从头读到尾,我们需要把单细胞里的微量DNA扩增,然后用新一代测序仪来测序

 

大家可能听说过PCR,是30 多年前的一个DNA放大技术,对生物学、医学有很大贡献,得了诺奖。PCR非常灵敏,在犯罪现场有一个DNA分子,PCR就可以把它放大,测出信号。但是PCR有很大偏差,有些基因被放大的倍数很高,有些很低。用它来放大整个的基因组,覆盖率只有5%。

 

 

2012年我的哈佛实验室发明了一种单细胞扩增技术叫MALBAC。它的名字很像红酒MALBEC。它大大提高了单细胞基因组扩增的均匀度、覆盖率和测序的精准度后来我们又发明了一个更精准的扩增方法叫LIANTI,也是一个红酒的名字。

 

那我们为什么要做单细胞测序呢?我给大家举一个实际应用的例子。我们团队和北医三院的乔杰团队、北京大学的汤富酬团队合作,把这个技术用到生殖医学。在试管婴儿的过程中筛选没有遗传缺陷的受精卵,以避免父母的遗传疾病遗传到下一代。这是2014年在北医三院诞生的首个“MALBAC婴儿”,一个非常漂亮的女婴。我们去看她的时候,一声都没哭,还一个劲冲我笑。迄今为止,在国内也有多于一千对夫妇成功地避免了单基因遗传疾病的后代传递。

 

单细胞的测序不仅可以是基因组,而且可以是转录组,也就是所有被表达的信使RNA的序列。我们中心的汤富酬教授十年前在英国做博士后的时候,首次用新一代测序仪测出了单细胞的转录组。转录组很重要,因为它决定了细胞的功能。一般来讲,不同种类的体细胞,它们的基因组都一样,但转录组不同,因此功能不同。

 

这是我们最近和富酬等北大同事一起合作的数据。每个点代表一个单细胞,点的位置不一样,因为它们的转录组不一样,表达量不一样。同一种细胞型的细胞会形成一个点簇,我们用不同颜色标记不同细胞种类。单细胞转录组已经被广泛用于细胞分型。

 

我们现在就是用这种单细胞转录组实验给康复期病人血液中成千上万的B细胞分型。我们先把单个B细胞从血液里分离出来,然后测定每个细胞的转录组。同样这里每个点代表一个B细胞,不同的颜色代表不同的B细胞种类。

 

人们知道B细胞是由骨髓产生的,从造血干细胞开始逐渐成熟,然后活化,最后变成浆细胞和记忆B细胞。这些不同的细胞种类我们都能看到。我们最关注的是记忆B细胞

 

我刚说过,一般来讲,在一个人身上,不同器官的细胞都有同样的基因组和不同的转录组。但是B细胞在成熟过程中,它的基因组是可以被重组的。为了这个发现,日本科学家Tonegawa在1987年获得了诺贝尔奖。在第14号染色体上,有V、D、J三个区域。V区域有40个相似但不同的DNA序列,D有23个,J有6个序列。

 

当B细胞从不成熟到成熟状态转变的过程中,基因组开始重组,就像从V、D、J三套牌各抽出一张。这样转录和翻译产生的抗体就有很多种。有多少种呢?40x23x6 =5520种,但这还不是全部。因为这个14号染色体只是合成重链(蓝色),而轻链(白色)是由在第2号或22号染色体上产生的。它们有 V和J,但是没有D。除了V(D)J重组,还有碱基的随机突变,都加在一起使得最后DNA序列的种类达到107-108种,为免疫系统提供了多样性。

 

抗体是用Y字型结构上的两把“钳子”,来捕捉抗原。这钳子嘴的形状以及与抗原结合的强度,取决于它氨基酸的序列。这里我要强调,我们特别需要单细胞的测序技术,因为每个B细胞通过V(D)J重组只产生某个特定的抗体蛋白

 

神奇的是,这107-108种产生不同抗体的B细胞,在抗原还没有来的时候,已经在血液和淋巴液里产生了。而当某一种抗原到来后,与它结合的抗体是怎么被发现和富集的呢?

 

在B细胞在未成熟到成熟的过程中,这些抗体分子IgM被放在细胞的表面作为B细胞的受体。这些细胞一直不分裂,直到某个抗原,比如S蛋白,结合到BCR上,给这个B细胞一个信号,它就被激活了,开始细胞分裂,一变二,二变四,这种B细胞就被富集了。

 

然后被富集的B细胞演化成浆细胞和记忆B细胞。浆细胞分泌IgG抗体到血液和淋巴结。而记忆B细胞留在骨髓和淋巴结很长一段时间。

 

因为记忆B细胞表面上有BCR也就是B细胞受体。我们可以用新冠抗原把记忆B细胞从康复期病人的血里分离出来测序。

 

记忆B细胞的IgG抗体和浆细胞分泌的IgG抗体,接受同样的抗原,因为它们两对钳子可变区的序列和结构都是一样的,只是固定区的序列和结构不同–––在V(D)J区域后用的是不同的C区域序列。

 

让我们看IgM和IgG抗体随着时间的变化,第一次感染后,3天内出现IgM抗体,量不是太大,保留时间不长。

 

顺便说一下,钟南山院士的团队的抗体检测就是检测IgM抗体。这方法很方便,只用手指上取一滴血就可以了。但是感染后必须要等几天才能知道。

 

我们想找的IgG一两个星期以后才出来。持续3、4周,之后会减少。所以我们需要回访的出院病人需要在这个时间段,如果康复时间太久了,IgG的量会越来越少。人类的免疫系统可以保证,如果第二次感染再发生的时候,免疫反应可以产生大量的IgG。

 

好,原理是这样的,实验怎么样?这是云龙和文洁,孙文洁是我们中心的生物信息专家,他们拿到的一号病人数据。

 

 

这里的六个记忆B细胞,它们的重链和轻链都有同样的V(D)J序列,他们来自同一个母细胞,也有随机的点突变。我们的假设是拥有同一种V(D)J序列的细胞数目越多,该细胞越有可能有好的免疫功能。这成为我们的第一筛选标准。这个选择标准用传统的单细胞克隆方法难以实现。因为我们有高通量的单细胞测序,就可以利用这个假设来高效得筛选

 

另外我们拿到这个V(D)J序列,就可以在体外生产这个抗体。利用这个生物学的中心法则,我们可以交给一个公司来做。

 

用这种方法我们找到了一些与S蛋白有很强结合力的抗体,也找到了几个中和抗体。但是这种方法的效率还是不够高,因为抗体的种类还是太多了。

 

后来我以前哈佛的博士生张旭加入了我们。她把小磁珠跟S蛋白或RBD连接起来,用这块磁铁把能和S蛋白或RBD结合的记忆B细胞从血液中分离出来。这样一来效率就大大提高了。

 

找到抗体后我们首先就测它的结合强度。抗体与S蛋白结合强弱是以结合常数来衡量的。左图横轴代表抗体在溶液中的浓度,竖轴代表与S蛋白的结合程度。抗体的浓度越高,结合程度就越高。当结合程度达到50%,抗体的浓度就是它与S蛋白的结合常数,这个抗体是40pM。这个数越低,表明结合强度越高。虽然听起来抽象,但这40pM 对应每升血液里只需要打入6毫克抗体,当然是越低越好。

 

 

中和抗体需与ACE2竞争。根据近来文献报道,ACE2与S蛋白结合常数是35nM,如右图,比抗体与S蛋白的结合常数高得多,所以结合强度低得多。

 

但我想强调,抗体结合力强不一定有中和能力,还要看结合的是不是S蛋白上关键部位。所以我们必须要做病毒的中和实验

 

郑英慧是我们实验室做中和实验的能手。我们先做的是假病毒实验,因为不需要P3实验室。这个横轴还是中和抗体的浓度。当抗体浓度特别高的时候,在细胞培养液里的病毒与抗体结合,而不进入细胞,当抗体浓度低的时候可以看到它进去,病毒进入细胞通过荧光指示。当抑制强度达到50%的时候抗体的浓度被称作半抑制浓度,对于这个抗体我们当时看到的是50pM,0.008微克/毫升,假病毒实验成功后,下一步就是到P3实验室看真病毒被抗体抑制的情况。

 

 

这是最近从P3实验室得到的体外实验数据,让我们非常高兴。这3个抗体的半抑制浓度都小于1μg/mL(1-10nM)。这个实验主要是看细胞的死亡。左图中,抗体浓度较低时,细胞受感染而凋亡。右图中,在中和高抗体浓度的时候,病毒感染被有效抑制。

 

总结一下我们已经从70个康复期病人血浆里的三十万个B细胞中,筛选出300个富集度最高的IgG抗体序列。

 

根据这些序列已经生产出300个抗体蛋白,正在测试,目前已筛出一大批高结合强度的抗体(kD=10 pM-10nM)和多个有出色中和活性的抗体。

 

高通量单细胞转录组和V(D)J测序,可直接检测B细胞的富集程度,使得我们可以快速精准地筛选出大量优质的中和抗体。

 

后续的动物实验已在筹划中,临床实验是下一步

 

筛选出的中和抗体有两个应用。一是可以用于新冠肺炎的中和抗体治疗,更安全且针对性强。

 

二是用于短期预防,保护我们的医护人员和病人家属,有效期大概3周,经过抗体改造有可能延长至3个月。

 

国内另外几个团队也一直在寻找中和抗体。我们的目标都是一致的,希望找到最好的抗体,尽早成药!

 

我们的工作为将来可能出现的疫情做好了准备。用我们的新方法,对病毒有良好中和活性的抗体应该在十天之内就可以找到。

 

 

最后我想说,去年八月,在中美贸易战, 以及我与美国科学家的合作受阻的背景下,我在Cell杂志发表了这篇文章《Disease Has No Borders, Neither Should Research》。果然如此,这次疫情使人们自觉或不自觉地认识到,病毒没有国界,抗疫也应如此!目前中国住院的病人已经越来越少,我们的临床试验也将要在疫情更为严峻的地方来进行。如果成药,我们不会命名它为“中国抗体”,因为它的使用应该是没有国界的

 

今晚我之所以能在这里跟大家分享,是因为我身边这些并肩作战的伙伴,我的团队,还有合作者,很多都是疫情之后认识的。我也非常感谢北京市政府、北京市教委的大力支持和北京市科委的协调推动!

 

这是我们的中心。北京大学生物医学前沿创新中心是一个以技术驱动为核心的多学科交叉的生命科学研究中心。北京未来基因诊断高精尖创新中心于2016年在北京市教委的支持下成立,专注于基因技术研发及其医学应用。中心许多同事最近也都投身到有关抗疫的研究中,利用自己的专长,为控制疫情贡献力量。

 

最后我也想对年轻的朋友们说几句话。未来论坛一直倡导年轻人热爱科学、投身科学。科学的重要性通过这次疫情得到了最好的体现。两个月来,我和我的团队与世界上许许多多科学工作者夜以继日、争分夺秒地工作。这是因为我们坚信,科学一定可以战胜病毒,使人类免于灾难。而疫情在各国的发展轨迹也证明,政治家的决策是否得当,在相当程度上取决于他对科学的了解,和对科学的尊重!

 

我的讲座就到这里,谢谢大家!

 

 

 

Q & A

直播间观众提问与解答


 

Q1:患者康复后复阳是什么原因?是否存在不产生抗体的人群?

A:人的免疫系统因人而异,一般来讲年纪大的人免疫系统会有些退化,这也是为什么年纪大的新冠肺炎患者更容易转重症。刚才谈到记忆B细胞,按道理讲记忆B细胞会回到骨髓里面,二次感染后它可以马上大量增殖。实话说我不是这方面的专家,我觉得复阳是由于免疫功能不完善,也就是记忆B细胞产生的IgG抗体不够多。这里也有很多未知的因素,我认为主要是人类免疫功能的不完善所导致的。

   

Q2:您和您的团队对本次疫情持续的时间是如何预测的?请问从寻找中和抗体到药物正式投入使用的周期有多长?对于治疗此次新冠病毒是否来得及?

A:有人预测疫情蔓延到南半球,然后又回到北半球。也有人预测夏天消失,冬天会再来。我也不知道疫情究竟会如何发展。但如果病毒十月份再回来,那时候我们的中和抗体可能已经研制成功了。我认为距离实际使用大概还需要几个月。

   

Q3:近期听说使用恢复期血浆治疗有效?也有人说还存在促进炎症风暴的风险,请问中和抗体存在类似风险吗?

A:这是一个很好的问题。我刚才讲的是中和抗体的优点。它的特异性好,相对小分子药物来讲,研发的时间短。那有没有什么副作用呢?我不确定它是否和炎症风暴有关,不过已知的副作用是抗体依赖增强作用(ADE):抗体进入人体是要中和病毒的,但是有的时候它会结合病毒后把病毒拉入人体细胞。当然这个ADE是要尽量避免的。但好消息是ADE还是比较罕见的,而且这个现象与抗体有关,我们可以从多种抗体中筛选出一个不产生ADE现象的。

   

Q4:请问中和抗体药物制造是否成本很高?是针对危重病人还是所有病人都用得上?

A:一般来讲,大分子药物要比小分子药物贵。但小分子药物每天都得吃,而抗体药物可能只用打一针。我们希望做的药也是打一针就见好。不过像HIV那个抗体药过一阵就得打一针,确实比较贵。我们现在就想先把药做出来,价格我也不清楚。

   

Q5:第五个问题,中和抗体药物用来预防能持续多久?进入体内抗体多久会消失?

A:我刚才说药效大概三个星期,但是它的半衰期是可以控制的。最近有很多工作,把病毒的恒定区的序列改变后,可以延长抗体的寿命,所以说抗体药效持续三个月是有可能的。但它毕竟和疫苗不一样,中和抗体的预防药效不会是永久的。

 

----本文转载自未来论坛公众号