消化系统是人体中最重要的器官系统之一，而消化道作为消化系统最重要的组成部分、其在食物消化、营养吸收、废物排泄、抵抗微生物入侵等多个方面起着极其重要的作用。消化道主要由食道、胃、小肠、大肠组成。揭示这四种器官在人类胚胎发育过程中的基因表达调控网络以及“细胞类型图谱”是发育生物学的重大问题。
2018年5月25日，北京大学生物动态光学成像中心汤富酬课题组与葛颢课题组，携手北京大学第三医院乔杰课题组联合在国际知名学术期刊《Nature Cell Biology》上在线发表了题为“Tracing the temporal-spatial transcriptome landscapes of the human fetal digestive tract using single-cell RNA-sequencing”的研究论文。在国际上首次在单细胞分辨率和全转录组水平，全面、系统、深入地阐明了食道、胃、小肠和大肠这四种器官在人类胚胎发育过程中的基因表达图谱及其信号调控机制，揭示了这四种器官不同细胞类型之间的精准发育路径和基因表达特征，并进一步详细解析了大肠从胎儿到成人的发育、成熟路径和关键生物学特征。
本项研究首先分离并获取了人类6到25周胚胎中食道、胃、小肠和大肠以及成年人的大肠总计5,277个单细胞，并对其进行了高精度的单细胞转录组测序，获得了多达5T的基因表达谱数据。针对这些数据该团队结合t-SNE，KNN，PCA，Monocle2和StemID等多种生物信息学分析方法进行深度数据挖掘，全面系统地对这四种器官的发育进程在基因表达调控层面进行了深入的解析。主要发现有：
（1）通过关键基因表达特征定义了这四种器官共40种不同的重要细胞类型，其中在人类胚胎发育阶段鉴定出30种不同的细胞类型。通过对胚胎发育时期的这30种细胞类型的关键生物学特征，特别是其独特发育路径，交互信号通路网络，细胞周期分布，营养代谢状态和营养吸收特点，以及层级转录因子调控网络等特征进行了细致翔实的分析后发现，其中具有干、祖细胞特征的细胞类型有19种，并且与其它11种已经分化成熟的细胞类型相比，其在胚胎发育的较早期就已经出现并且贯穿于整个胚胎发育时期，其细胞周期也呈现出活跃分裂增殖的特点。另一方面，整体的基因表达聚类分析显示出胚胎早期消化道的四种不同器官的细胞虽然已经具有明确的空间分布差异和不同的形态特征，但是仍然具有高度相似的基因表达特点，而胚胎晚期这四种不同器官的细胞基因表达差异非常明显，显示这些细胞类型功能成熟后基因表达的高度器官特异性和细胞类型特异性。同时小肠同其它三种消化道器官相比，营养吸收代谢的关键基因在胚胎晚期被大规模同步激活，说明处于胚胎晚期的小肠可能已经具备了基本的营养吸收功能。这也说明随着胚胎发育的进行，四种器官在功能上的差异性也逐渐展现出来。
人类胚胎发育过程中食道、胃、小肠、大肠的细胞类型图谱及其关键生物学特征
（2）通过胚胎发育的时间轴进行纵向分析，该研究发现了一系列在胚胎发育早期（6W-11W）、中期（12W-18W）和晚期（19W-25W）阶段特异性表达的标志基因，这为多能性干细胞体外分化形成各种有功能的消化道细胞类型提供了重要的候选标志基因以及基因表达谱的金标准。进一步的Gene Ontology分析发现在胚胎发育早期的消化道是以干、祖细胞的快速增殖和保持未分化状态为主要特征，而胚胎发育中期的消化道则初步建立了消化功能和免疫功能，提示在多能性干细胞体外定向分化过程中要密切关注免疫细胞对于消化道细胞的分化成熟可能发挥的重要调控作用。胚胎发育晚期的消化道则主要以组织细胞的结构特化和消化吸收功能特化和成熟为主要特征。另一方面，通过这四个器官的空间轴进行横向比较分析，发现在胚胎发育早期，四个消化道器官之间差异很小（不同器官之间差异表达的基因只有259个），来自不同器官的细胞其基本基因表达特征仍然非常相似，而到了胚胎发育晚期，四个消化道器官之间差异巨大（不同器官之间差异表达的基因增加到1193个），这也反映出消化道不同器官在发育过程中的功能特化和细胞类型差异不断积累的特点。
（3）在消化道四种器官的发育过程中，通过解析单细胞水平上的基因表达调控网络发现，对于发育起核心调控作用的HOX家族的基因，不同的HOX基因在不同的消化道器官中可能起着关键的区域化调节作用。在Hedgehog信号通路中，IHH配体可能起到了关键作用，并且发现间充质与上皮细胞之间存在旁分泌作用，同时在小肠和大肠还发现Wnt，FGF，TGF-β和BMP等信号通路协同调控着它们的发育过程。
人类胚胎发育过程中小肠的信号通路等调控模式示意图
（4）针对大肠的发育进程，该研究进一步获取了成年人大肠高精度的单细胞转录组数据，首次系统地研究了大肠从胎儿到成人的发育过程，成年人大肠中10种主要的细胞类型都被精确地鉴定出来。该研究系统地揭示了包括大肠干、祖细胞，肠上皮细胞，杯状细胞等功能成熟的细胞类型的核心基因表达模式和关键标志基因等重要生物学特征。在胎儿发育的后期，大肠中的细胞类型以及其基因表达模式与成年人阶段已经很接近，其中一些特定细胞类型的关键基因的表达也都趋于一致，说明在胚胎晚期大肠的主要细胞类型可能已经具备了初步的食物消化和营养吸收功能。
成年人大肠中的细胞类型（左图）及大肠从胚胎时期到成年人阶段的发育路径（右图）
该项研究首次系统、全面、深入地同时将消化系统最重要的食道，胃，小肠，大肠四个主要器官在单细胞转录组水平上进行了时空交叉的深度解析。这四种器官，尤其是小肠，一直被作为研究细胞类型之间的相互作用以及成体干细胞的干性维持和分化的经典模型。本研究的发现无疑为消化道生物学研究领域提供了全面翔实的发育细胞图谱数据，具有重大参考价值，同时也为体外多能性干细胞定向分化为消化道相关细胞类型建立了基因表达图谱金标准。另一方面，对于这四种消化道器官相关的癌症，特别是胃癌和结直肠癌的致病机理研究，此项研究结果也在基因表达层面上提供了重要参考。
北京大学生物动态光学成像中心的博士后高帅、博士生汪睿，博士生李静云、以及北医三院闫丽盈博士为该文章并列第一作者，汤富酬教授、乔杰教授、及葛颢教授为该文章的共同通讯作者。此项工作得到了国家自然科学基金委、科技部、未来基因诊断高精尖创新中心（ICG）、以及生命科学联合中心（CLS）的支持。
