我国乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus, HBV）携带者约有7000万例，其中慢性乙型肝炎（Chronic Hepatitis B，CHB）患者约2000万～3000万例[1]。目前，临床上用于CHB治疗的药物主要包括干扰素和核苷（酸）类似物（NAs），抗病毒治疗能够有效抑制病毒复制，降低HBV相关肝硬化、肝癌的发生风险。但仅极少数患者可以实现“功能性治愈”，即达到乙肝表面抗原（Hepatitis B surface antigen, HBsAg）转阴。大量CHB患者需长期乃至终身抗病毒治疗，极大降低了患者的生活质量并造成沉重负担。
大部分成年人感染HBV后可以自愈，在围产期和婴幼儿时期发生的HBV感染，分别有90%和25%~30%将发展成CHB。根据抗原及血清学特点，CHB可进一步分为免疫耐受期、免疫活化期、免疫控制期和再活动期。急性HBV感染过程中，病毒的清除主要依赖于机体的免疫系统。在CHB患者中，病毒持续复制、病毒抗原大量存在并伴随免疫功能紊乱。受限于肝脏样本可及性及传统研究技术手段，既往HBV感染相关临床转化研究大多使用外周血样本。而基于动物模型及少量包含患者肝组织取样的研究显示，肝脏原位的抗HBV免疫应答与外周存在很大差异，且对疾病转归更为关键[2]。因此，系统解析HBV感染肝脏的免疫特征，阐明不同疾病阶段建立、维持和转化的免疫效应机制，将有助于开发CHB免疫治疗新策略以提高临床治愈率。
2022年3月31日，解放军总医院第五医学中心王福生院士、北京大学生物医学前沿创新中心（BIOPIC）张泽民教授、任仙文研究员（现工作单位：昌平实验室）合作在GUT上在线发表了题为Single-cell RNA sequencing reveals intrahepatic and peripheral immune characteristics related to disease phases in HBV-infected patients的研究论文。在该项研究中，研究人员对来自23个人46个外周血和肝脏配对样本的24.3万个细胞进行单细胞免疫组库测序，首次深度剖析了HBV感染不同阶段的肝脏和外周免疫微环境特点。揭示在HBV慢性感染和急性感染中耗竭T细胞的动态变化特点和免疫细胞互作网络。本研究系统解析了HBV不同感染阶段的免疫反应特征，揭示HBV免疫发病新机制。
图1. 论文首页
研究入组乙肝感染不同阶段患者（包括免疫耐受期—IT，n="6；免疫活化期—IA，n=5；急性感染恢复期—AR，n=3；慢性感染治愈患者—CR，n=3）和健康肝移植供者（HC，n=6）作为对照。留取入组对象外周血和肝穿组织，流式分选富集CD45+免疫细胞，利用10X" Genomics单细胞测序平台进行单细胞转录组、TCR、BCR分析。研究共纳入来自23个人的46个样本，得到24.3万个免疫细胞单细胞转录组。解析了CD8+ T、CD4+ T、NK、gdT、B、髓系细胞等8个主要免疫细胞群和60个亚群的转录特征及变化特点。
图2. 研究设计
根据转录组特征，CD8+ T细胞可进一步分为12个亚群，包括在外周血中富集的初始（c01-LEF1）、效应（c03-CX3CR1）亚群和在肝脏中富集的耗竭（c08-LAYN）、MAIT （c11-SLC4A10）亚群等。通过比较CD8+ T细胞在不同分组间的变化特点，发现相较于HC组，耗竭CD8+ T细胞（Tex）在IT、IA和AR组肝脏中增多，其中IA和AR的增加幅度更大且呈现更显著的耗竭相关转录特征。进一步通过基于TCR追踪的STARTRAC算法[3]对CD8+ T细胞的动态特点（包括克隆扩增、表型转换及组织间迁移）进行分析，IA和AR两组间呈现显著差异。其中IA组耗竭CD8+ T细胞主要来自于自身克隆扩增；而AR组耗竭CD8+ T细胞更多来自外周效应T细胞的浸润和转化。同时发现，患者外周血一群CX3CR1+ 中心记忆CD8+ T（Tcm）细胞亚群的频率，具有预测HBV清除的潜在应用价值。
图3. CD8+ T细胞特征
对CD4+ T细胞和髓系细胞的分析发现，肝脏驻留的调节性CD4+ T细胞（Treg, CD4T_c09-CTLA4）在慢性感染期患者（IT和IA）肝脏中富集，调节性巨噬细胞（Mreg, macro_c03-FCGR3A）在IT期富集。通过CSOmap算法[4]对细胞的空间互作关系进行分析发现，在慢性感染期患者肝组织中，特异性存在Treg-Tex-Mreg的互作网络。并通过多色免疫组化对生信发现进行验证，确定了慢性感染期患者肝脏三群细胞的空间邻近关系并鉴定Tex细胞上HLA-I类分子和Mreg上白细胞免疫球蛋白样受体 (LILR)是潜在的互作效应信号。
图4. CHB患者肝组织中Tex与Treg和Mreg的互作
研究人员对患者免疫特征和临床指标的关系进行分析，发现肝脏髓系细胞组分的改变与患者血浆HBV DNA和HBsAg水平相关，而患者间T细胞组分的异质性主要与血浆转氨酶水平、肝组织病理炎症分期相关。这些发现提示病毒抗原或直接诱导的天然免疫细胞的改变，而T细胞的功能紊乱与患者的肝组织损伤程度密切相关。
图5. 免疫特征与临床指标的关联
综上，本研究提供了一个全面的单细胞免疫组图谱来描述HBV感染患者不同阶段肝脏和外周的免疫特征。IT患者的特点是肝脏中Treg、Tex细胞增加。这些变化在IA患者中更加明显，并与肝脏损伤程度相关。Treg-Tex-Mreg在IT和IA期表现出强相互作用。这种免疫细胞互作网络可能促进HBV持续感染及肝组织病变。急性HBV感染中也表现Tex增多，但与IA相比其来源不同。此外，外周血CX3CR1+Tcm细胞可作为一个预测病毒清除的免疫指标。这些发现为理解HBV感染的免疫机制迈出了重要的一步，将有助于开发更有效的治疗靶点和CHB患者的免疫治疗的生物标志物。
解放军总医院第五医学中心张超副研究员、程勇前副主任医师，北京大学BIOPIC博士李杰圣（现工作单位：深圳湾实验室）为该论文的并列第一作者，解放军总医院第五医学中心王福生院士、北京大学BIOPIC张泽民教授、任仙文研究员（现工作单位：昌平实验室）为该论文的共同通讯作者。该课题得到了国家自然科学基金和重点研发计划项目的资助。
论文链接：
https://gut.bmj.com/content/early/2022/03/30/gutjnl-2021-325915
参考文献：
[1] 王贵强, 段钟平, 王福生, 等. 慢性乙型肝炎防治指南 (2019 年版)[J]. 中国病毒病杂志, 2020, 10(1): 1-25.
[2] Gill U S, Pallett L J, Thomas N, et al. Fine needle aspirates comprehensively sample intrahepatic immunity[J]. Gut, 2019, 68(8): 1493-1503.
[3] Zhang L, Yu X, Zheng L, et al. Lineage tracking reveals dynamic relationships of T cells in colorectal cancer[J]. Nature, 2018, 564(7735): 268-272.
[4] Ren X, Zhong G, Zhang Q, et al. Reconstruction of cell spatial organization from single-cell RNA sequencing data based on ligand-receptor mediated self-assembly[J]. Cell research, 2020, 30(9): 763-778.
